根据起终点设置需要，11月15日20:00开始至比赛结束，江东中路（奥体大街至梦都大街段）双向道路、奥体大街（江东中路至燕山路段）双向道路、燕津大道（燕春路至嘉善路段）双向道路实行临时封闭，禁止车辆通行。
根据比赛进程，11月16日7:00开始至比赛结束，下列时间、道路除持2025南京马拉松赛专用证件的车辆和人员外，车辆和行人按以下规定分时、分段禁止通行：
| 序号 | 封闭开始时间 | 封闭路段及方向 | 限制规定 |
| 01 | 7时10分起 | 梦都大街（江东中路至西城路段），双向 | 禁止机动车辆通行（持2025南京马拉松赛专用证件的车辆和人员除外） |
| 02 | 7时15分起 | 西城路（梦都大街至应天大街段），双向 | |
| 03 | 7时20分起 | 应天大街（西城路至雨花路段），西向东方向地面道路 | |
| 04 | 7时25分起 | 1. 雨花路（应天大街至中华门城堡段），双向；2. 中华路（中华门城堡至白下路段），双向 | |
| 05 | 7时30分起 | 1. 白下路（中华路至中山南路段），双向；2. 中山南路（白下路至中山东路段），双向 | |
| 06 | 7时35分起 | 1. 中山路（中山南路至长江路段），双向；2. 长江路（中山路至汉府街段），双向 | |
| 07 | 7时45分起 | 1. 汉府街（长江路至龙蟠中路段），双向；2. 龙蟠中路（汉府街至珠江路段），北向南方向；3. 龙蟠中路（珠江路至北京东路段），南向北方向 | |
| 08 | 7时50分起 | 北京东路（龙蟠中路至太平门），西向东方向 | |
| 09 | 7时55分起 | 龙蟠路（太平门路至太阳宫段），北向南方向 | |
| 10 | 8时10分起 | 1. 神武路（玄武门至板井巷段），双向；2. 板井巷（神武路至新模范马路段），双向；3. 中央路（板井巷至新模范马路段），双向 | |
| 11 | 8时15分起 | 模范马路一线（中央路至淮滨路段），东向西方向地面道路 | |
| 12 | 8时30分起 | 淮滨路（模范西路至江边南路段），双向 | |
| 13 | 8时35分起 | 江边路一线（南通路至宝塔桥西街段），双向 | |
| 14 | 8时45分起 | 宝塔桥西街（江边路至燕江路段），双向 | |
| 15 | 8时50分起 | 燕江路（象山路至中央北路段），双向 | |
| 16 | 8时55分起 | 永济大道（中央北路至和燕路段），双向 | |
| 17 | 9时15分起 | 燕津大道（和燕路至燕春路段），双向 |
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